CHARACTERIZATION OF AMINE OXIDASE USING OXIDATION OF IRON (II)

Abstract

Amine oxidase is an enzyme that catalyzes the oxidative deamination of biogenic amines into aldehydes, ammonia and hydrogen peroxide (H2O2). Usually, amine oxidase activity is studied by determining the production of H2O2 using coupling reactions with peroxidase and chromogenic reagents. Therefore, the aim of this work was to characterize amine oxidase using the oxidation of Fe (II) by H2O2 instead of peroxidase. Firstly, the spectrophotometric determination of H2O2 was studied using Fe (II) with norfloxacin as a reagent. The results showed that this method was able to detect H2O2 at various concentrations. The linear range, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of this method were 6.25 - 300 μM, 0.44 μM and 0.73 μM, respectively. After that, another method was developed by changing the reagent from norfloxacin to tripyridyltriazine (TPTZ) for H2O2 determination. The results showed that this method was also able to detect H2O2 at various concentrations. The linear range, LOD and LOQ of this method were 50.00 - 225 μM, 21.99 μM and 41.66 μM, respectively. Both methods were available for H2O2 determination and the coupling reaction with peroxidase. Eventually, the researchers applied these developed methods to investigate the characterization of amine oxidase, using histamine as a substrate. The results revealed that the both methods were able to use the study of kinetics of amine oxidase. However, they provided inaccurate Km and Vmax from the kinetic values, determined by using the coupling method with peroxidase.

เอนไซม์เอมีนออกซิเดสเป็นเอนไซม์ที่สามารถเร่งปฏิกิริยาออกซิเดทีฟดีแอมมิเนชันของไบโอจีนิกเอมีน ให้ได้ผลิตภัณฑ์เป็นสารประกอบแอลดีไฮด์ แอมโมเนีย และไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H2O2) ซึ่งการศึกษาแอคติวิตีของเอนไซม์เอมีนออกซิเดสนี้นิยมทำโดยการติดตามปริมาณของ H2O2 ที่เกิดขึ้น และอาศัยปฏิกิริยาควบคู่กับเอนไซม์เปอร์ออกซิเดสร่วมกับซับสเตรตที่ทำให้เกิดสีได้ ดังนั้นงานวิจัยนี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาลักษณะสมบัติของเอนไซม์เอมีนออกซิเดส โดยใช้ปฏิกิริยาออกซิเดชันระหว่าง H2O2 และเหล็ก (II) ทดแทนการใช้เอนไซม์เปอร์ออกซิเดส เริ่มจากการศึกษาวิธีตรวจวัด H2O2 ด้วยเทคนิคสเปกโตรโฟโตเมตรีโดยใช้เหล็ก (II) ร่วมกับนอร์ฟลอกซาซินเป็นรีเอเจนต์ ผลการทดลองที่ได้พบว่า วิธีการตรวจวัดนี้สามารถหาปริมาณ H2O2 ที่ความเข้มข้นต่าง ๆ ได้ โดยได้ช่วงความเป็นเส้นตรงที่ความเข้มข้น 6.25 - 300 µM มีขีดจำกัดในการตรวจพบ (LOD) และขีดจำกัดในการตรวจวัดเชิงปริมาณ (LOQ) เท่ากับ 0.44 µM และ 0.73 µM ตามลำดับ หลังจากนั้นผู้วิจัยจึงได้เปลี่ยนรีเอเจนต์จากนอร์ฟลอกซาซินไปเป็นไตรไพรีดิลไตรเอซีน (TPTZ) เพื่อใช้ในการตรวจวัด H2O2 ผลการทดลองที่ได้พบว่า วิธีการตรวจวัดนี้สามารถหาปริมาณ H2O2 ที่ความเข้มข้นต่าง ๆ ได้ โดยได้ช่วงความเป็นเส้นตรงที่ความเข้มข้น 50.0 - 225 µM มีค่า LOD และค่า LOQ เท่ากับ 21.99 µM และ 41.66 µM ตามลำดับ ซึ่งทั้งสองวิธีนี้สามารถตรวจวัดปริมาณ H2O2 ได้เช่นเดียวกับการใช้เอนไซม์เปอร์ออกซิเดส ต่อจากนั้นผู้วิจัยได้นำวิธีที่พัฒนาขึ้นนี้ไปใช้ในการศึกษาลักษณะสมบัติของเอนไซม์เอมีนออกซิเดส โดยใช้ฮีสตามีนเป็นซับสเตรต พบว่าวิธีตรวจวัดที่ได้พัฒนาขึ้นทั้งสองวิธีสามารถนำไปใช้ในการศึกษาทางจลนพลศาสตร์ของเอนไซม์เอมีนออกซิเดสได้ แต่อย่างไรก็ตามวิธีที่พัฒนาขึ้นทั้งสองวิธียังคงให้ค่า Km และ Vmax ที่มีความคลาดเคลื่อนจากวิธีตรวจวัดโดยใช้เอนไซม์เปอร์ออกซิเดส