LUNG CANCER INHIBITORY ACTIVITY OF PURE COMPOUNDS EXTRACTED FROM BOESENBERGIA ROTUNDA

Abstract

The objectives of this study are to assess the cytotoxicity of panduratin A (PA) and pinostrobin (PN), both isolated from Boesenbergia rotunda rhizome, and to elucidate their underlying mechanisms in non-small cell lung cancer (NSCLC) cells, specifically those expressing wild-type EGFR (A549) and mutant EGFR (H1975). PA and PN were isolated from B. rotunda using an ultrasound-assisted extraction technique with n-hexane as the solvent, followed by a one-step purification process using centrifugal partition chromatography (CPC). The optimal conditions for high extraction efficiency prior to purification were a rhizome powder size of 125 µm, 10 minutes of ultrasound extraction with n-hexane, and a solid/liquid ratio of 1:30 g/ml. Under these conditions, the maximum yield of crude extract from B. rotunda rhizome was 6.96±0.07%, containing 10.48±0.34 mg/g of PA and 35.68±1.11 mg/g of PN. The mixture was partitioned and isolated using CPC with an optimal solvent composition of 5/3.4/1.6 (n-hexane/MeOH/water, v/v) in ascending mode. From 67 mg of crude extract, PA (0.4 mg, 99% purity) and PN (2.16 mg, 98% purity) were successfully purified. The purified compounds were accurately identified using LC-MS/MS QTOF by comparing their masses and fragmentation patterns to Pubmed library. The structures of PA and PN were further confirmed by ¹H-NMR analysis. In vitro cytotoxicity screening results demonstrated that PA exhibits potent cytotoxic effects on both A549 (IC50 of 6.03 ±0.21 µg/ml) and H1975 (IC50 of 5.58±0.15 µg/ml) NSCLC cell lines, with low toxicity against MRC5 normal lung cells (IC50 of 12.96±0.36 µg/ml). Furthermore, western blot results showed that PA reduces cell viability by inhibiting p-EGFR, p-STAT3 and p-Akt in both NSCLC cell lines, and activating p-AMPK in H1975 cells. In summary, the results of this study indicate that PA can be developed as an anticancer drug for NSCLC, both with wild-type and mutant EGFR, with comparable or superior efficacy to standard anticancer drugs.

วัตถุประสงค์ของการวิจัยนี้เพื่อศึกษาฤทธิ์ต้านมะเร็งปอดของสารแพนดูราทินเอ (PA) และพิโนสโตรบิน (PN) บริสุทธิ์ซึ่งแยกได้จากเหง้ากระชายขาวและกลไกการออกฤทธิ์ต่อเซลล์มะเร็งปอดชนิดเซลล์ไม่เล็ก (NSCLC) คือ เซลล์ A549 ที่มี EGFR ปกติและเซลล์ H1975 ที่มีการกลายพันธุ์ของ EGFR โดยสาร PA และ PN ถูกแยกจากเหง้ากระชายขาวโดยเทคนิคการสกัดด้วยคลื่นเสียงความถี่สูงร่วมกับตัวทำละลายเฮกเซน จากนั้นแยกสารให้บริสุทธิ์ในขั้นตอนเดียวด้วยเทคนิค centrifugal partition chromatography (CPC) ซึ่งสภาวะที่เหมาะสมในการสกัดสารออกจากเหง้ากระชายขาว คือ สกัดโดยใช้อนุภาคของผงกระชายขนาด 125 µm อัตราส่วนของผงกระชายต่อปริมาตรของเฮกเซนเท่ากับ 1:30 กรัม/มิลลิลิตร และใช้เวลาในการสกัด 10 นาที ภายใต้สภาวะนี้พบว่าให้ผลผลิตของสารสกัดหยาบจากเหง้ากระชายสูงสุดถึง 6.96±0.07% โดยพบปริมาณ PA เท่ากับ 10.48±0.34 มิลลิกรัม/กรัม และ PN เท่ากับ 35.68±1.11 มิลลิกรัม/กรัม ซึ่ง PA และ PN จากสารสกัดหยาบถูกแยกให้บริสุทธิ์ด้วยเทคนิค CPC ซึ่งพบว่าระบบการแยกสารด้วยส่วนผสมของเฮกเซน/เมทานอล/น้ำ ที่อัตราส่วน 5/3.4/1.6, ปริมาตร/ปริมาตร ด้วย ascending mode สามารถสกัดสาร PA และ PN จากสารสกัดหยาบ 67 มิลลิกรัมได้ดีโดยให้ปริมาณ PA 0.4 มิลลิกรัม ที่ความบริสุทธิ์ 99% และ PN 2.16 มิลลิกรัม ที่ความบริสุทธิ์ 98% สารบริสุทธิ์ที่ได้ถูกยืนยันความถูกต้องของชนิดสารด้วย LC-MS/MS QTOF โดยเปรียบเทียบมวลและรูปแบบการแตกตัวกับฐานข้อมูล PubMed นอกจากนี้โครงสร้างของสารบริสุทธิ์ PA และ PN ถูกพิสูจน์ด้วยเทคนิค ¹H-NMR และจากผลการศึกษาความเป็นพิษต่อเซลล์ของสารบริสุทธิ์ที่แยกได้ พบว่า PA มีความเป็นพิษต่อเซลล์เซลล์มะเร็งปอดชนิด NSCLC ทั้งสองสายพันธุ์ โดย A549 มีค่า IC50 เท่ากับ 6.03 ±0.21 µg/ml และ H1975 มีค่า IC50 เท่ากับ 5.58±0.15 µg/ml และมีความเป็นพิษต่ำต่อเซลล์ปอดปกติ MRC5 มีค่า IC50 เท่ากับ 12.96±0.36 µg/ml นอกจากนี้ผลการวิเคราะห์หาโปรตีนด้วยวิธี western blot แสดงให้เห็นว่า PA สามารถลดความมีชีวิตรอดของเซลล์โดยการยับยั้ง p-EGFR, p-STAT3 และ p-Akt ในเซลล์มะเร็งปอด NSCLC ทั้งสองสายพันธุ์ และกระตุ้น p-AMPK ในเซลล์ H1975 โดยสรุปจากผลการศึกษาครั้งนี้แสดงให้เห็นว่าสาร PA สามารถพัฒนาเป็นยาต้านมะเร็งปอดชนิด NSCLC ทั้งที่มี EGFR ปกติและที่มีการกลายพันธุ์ของ EGFR โดยมีประสิทธิภาพเทียบเท่าหรือดีกว่ายาต้านมะเร็งมาตรฐาน