THE PROTECTIVE MECHANISMS OF QUERCETIN ON THE LEAKINESS OF INTESTINAL EPITHELIAL CELLS INDUCED BY IL-1β THROUGH MLCK DEPENDENT SIGNALING PATHWAYS

Abstract

Interleukin-1beta (IL-1β) is an important mediator in gastrointestinal inflammation and increased intestinal tight junction permeability via nuclear factor-kappa B (NF-κB)/Extracellular signal-regulated kinases (ERK)1/2/myosin light chain kinase (MLCK) pathway. Flavonol quercetin has potent anti-inflammation and intestinal barrier-promoting effects. This study investigates the effect of quercetin on intestinal barrier function, its protective effect and mechanism of quercetin on IL-1β induced tight junction (TJ) barrier dysfunction via NF-κB/ERK1/2/MLCK pathway in human colonic epithelial cancer cell line. The Caco-2 cells were treated with quercetin 1, 10 and 100 µM in the presence or absence of IL-1β 10 ng/ml for 24 and 48 h. Intestinal barrier function was assessed by Transepithelial Electrical Resistance (TER) and paracellular permeability assay of fluorescein isothiocyanate-labeled dextran (4 kDa, FD-4). The expression of NF-κB, iκB, ERK1/2, MLCK and phospho-MLC (p-MLC) proteins and NF-κB and MLCK gene were analyzed by western blot and real-time PCR. The NF-κB translocation was determined by immunofluorescence staining. All concentrations of quercetin, with or without IL-1β, were not toxic to Caco-2 cells, as determined by MTT assay. Quercetin 1 and 10 µM had no significant effect on TER and FD-4 flux, while quercetin 100 µM decreased TER at 24 h and increased FD-4 flux at 48 h. Cell exposure to IL-1β for 24-48 h significantly increased FD-4 flux and inhibited by quercetin pretreatment at 1 and 10 µM for 48 h. All of the target protein expressions were unaffected by quercetin alone. In contrast, IL-1β increased NF-κB, ERK1/2, MLCK and p-MLC and decreased iκB protein expression during 12-24 h. The IL-β induced increase in NF-κB, ERK1//2 MLCK and p-MLC proteins was prevented by quercetin 1 and 10 µM. The inhibitory effect of IL-1β on iκB protein was also prevented by quercetin 10 and 100 µM. However, the expression of NF-κB and MLCK gene in response to quercetin and IL-1β were not to parallel with protein expressions. The preventive effect of quercetin on IL-1β was correlated with the quercetin effect on decreased FD-4 flux induced by IL-1β. In addition, quercetin 1 µM was found to inhibit nuclear translocation of NF-κB induced by IL-1β. All of the results suggested that quercetin, especially at low concentrations maintains proper intestinal barrier function under normal condition and prevents an increased paracellular permeability of intestinal epithelium induced by IL-1β via inhibition of NF-κB/ERK1/2/MLCK pathway. This provides the potential role of quercetin for therapeutic application in alleviation and protection of intestinal barrier leakiness associated with inflammation.

อินเตอร์ลิวคิน-วันเบต้า (ไอแอล-วันเบต้า) เป็นสารสื่อสำคัญในการอักเสบของทางเดินอาหารและเพิ่มการแพร่ผ่านของสารบริเวณไทด์จังชั่นของลำไส้ผ่านกลไกนิวเคลียแฟกเตอร์-แคปปาบี (เอ็นเอฟ-แคปปาบี) เอกตร้าเซลลูลาร์ซิกแนลเรกูเลตไคเนส (อีอาร์เค)1/2 และ ไมโอซินไลท์เชนไคเนส (เอ็มแอลซีเค) ฟลาโวนอลเควอซิทินมีผลต้านการอักเสบและกระตุ้นด่านป้องกันของลำไส้ การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์ที่จะตรวจสอบผลของเควอซิทินต่อการทำหน้าที่ของด่านป้องกันของลำไส้ ผลในการป้องกันและกลไกของเควอซิทินต่อไอแอล-วันเบต้าที่กระตุ้นการทำหน้าที่ที่ผิดปกติของด่านป้องกันของไทด์จังชั่นผ่านกลไกเอ็นเอฟ-แคปปาบี ไอแคปปาบี อีอาร์เค1/2 และเอ็มแอลซีเคในเซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่ของคน คาโคทูเซลล์ได้รับสารเควอซิทินที่ความเข้มข้น 1 10 100 ไมโครโมลาร์ร่วมกับการมีและไม่มีไอแอล-วันเบต้าเป็นเวลา 24 และ 48 ชั่วโมง การทำหน้าที่ของด่านป้องกันของลำไส้ถูกประเมินด้วยความต้านทานทางไฟฟ้าระหว่างเซลล์เยื่อบุ (ทีอีอาร์) และทดสอบการแพร่ผ่านทางช่องด้านข้างของเซลล์ของเดกซ์แทรนที่ติดสารเรืองแสงไอโซไทโอไซยาเนต (4 กิโลดาลตัน, เอฟดี-4) การแสดงออกของโปรตีนเอ็นเอฟ-แคปปาบี ไอแคปปาบี อีอาร์เค1/2 เอ็มแอลซีเค และ ฟอสโฟ-เอ็มแอลซี (พีเอ็มแอลซี) และการแสดงออกของยีนเอ็มเอฟ-แคปปาบีและเอ็มแอลซีเคถูกวิเคราะห์โดยเวสเทิร์นบลอทและเรียลไทม์พีซีอาร์ การเคลื่อนย้ายของโปรตีนเอ็มเอฟ-แคปปาบีถูกระบุด้วยการย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ เควอซิทินทุกความเข้มข้นทั้งมีและไม่มีไอแอล-วันเบต้าไม่เกิดความเป็นพิษต่อเซลล์ด้วยการวิเคราะห์โดยวิธีเอ็มทีที ในขณะเดียวกันเควอซิทิน 1, 10 ไมโครโมลาร์นั้นไม่มีผลต่อทีอีอาร์และการแพร่ผ่านเอฟดีโฟว์ ขณะที่เควอซิทิน 100 ไมโครโมลาร์ลดทีอีอาร์ที่ 24 ชั่วโมงและเพิ่มการแพร่ผ่านเอฟดีโฟว์ที่ 48 ชั่วโมง เซลล์ที่ใส่ไอแอลวัน-วันเบต้า 24-48 ชั่วโมงเพิ่มการแพร่ผ่านเอฟดีโฟว์อย่างมีนัยสำคัญและถูกยับยั้งโดยการใส่เควอซิทิน 1 และ 10 ไมโครโมลาร์ก่อนที่ 48 การแสดงออกของโปรตีนเป้าหมายทั้งหมดไม่มีผลโดยเควอซิทินเพียงลำพัง ในทางตรงกันข้ามไอแอลวัน-เบต้าเพิ่มการแสดงออกของโปรตีนเอ็นเอฟ-แคปปาบี อีอาร์เค1/2 เอ็มแอลซีเค พีเอ็มแอลซี และลดไอแคปปาบีระหว่าง 12-24 ชั่วโมง ไอแอลวัน-เบต้ากระตุ้นการเพิ่มการแสดงออกของโปรตีนเอ็นเอฟ-แคปปาบี อีอาร์เค1/2 เอ็มแอลซีเค และพีเอ็มแอลซี ถูกยับยั้งโดยเควอซิทิน 1 และ 10 ไมโครโมลาร์ ผลในการยับยั้งไอแอลวัน-เบต้าต่อโปรตีนไอแคปปาบีถูกป้องกันโดยเควอซิทิน 1 และ 10 ไมโครโมลาร์เช่นกัน อย่างไรก็ตามการแสดงออกของยีนเอ็นเอฟ-แคปปาบีและเอ็มแอลซีเคในการตอบสนองต่อเควอซิทินและไอแอลวัน-เบต้าไม่ได้สอดคล้องกับการแสดงออกของโปรตีน ผลในการป้องกันของเควอซิทินต่อไอแอลวัน-เบต้าสอดคล้องกับผลของเควอซิทินต่อการลดการแพร่ผ่านเอฟดีโฟว์เมื่อกระตุ้นด้วยไอแอลวัน-เบต้า นอกจากนั้นเควอซิทินถูกพบว่ายับยั้งการการเคลื่อนย้ายของโปรตีนเอ็มเอฟ-แคปปาบีเมื่อกระตุ้นโดยไอแอล-วันเบต้า ผลการทดลองทั้งหมดสรุปได้ว่าเควอซิทินโดยเฉพาะอย่างยิ่งที่ความเข้มข้นต่ำจะช่วยรักษาการทำหน้าที่ของด่านป้องกันของลำไส้ให้เหมาะสมในสภาวะปกติและป้องกันการแพร่ผ่านของสารผ่านทางช่องด้านช้างของเซลล์เยื่อบุลำไส้เมื่อกระตุ้นด้วยไอแอล-วันเบต้าผ่านการยับยั้งกลไกเอ็นเอฟ-แคปปาบี อีอาร์เค1/2 และเอ็มแอลซีเค สิ่งนี้แสดงถึงบทบาทที่เป็นไปได้ของเควอซิทินต่อการใช้งานรักษาในการบรรเทาและป้องกันการรั่วไหลของเยื่อบุลำไส้ที่เกี่ยวข้องกับการอักเสบ