DEVELOPMENT OF EXTRACTION AND VALIDATION METHODSFOR THE ANALYSIS OF EMODIN IN VENTILAGO DENTICULATA

Abstract

The HPLC system was developed in the chromatographic conditions of XSelect CSH, 5 μm C18 column, a size of 4.6x250 mm, a column maintained at 30oC, using 0.1% phosphoric acid solution and acetonitrile, mixed by a gradient system in the mobile phase, with a flow rate at 1.0 mL/min and a PDA detector of 288 nm. The chromatogram showed an emodin peak at about 10.8 minutes with a run-time of 20 minutes per injection. The specificity and selectivity parameters were proved by a good separation of emodin from other compounds. The concentration and the area under the curve were linear over a range of 1-10 μg of emodin per mL with a correlation coefficient of 0.9999. The accuracy of the method was assessed by percentage recoveries at three concentration levels, at 1.8, 3.5, 5.5 μg/mL were 101.99, 102.44 and 103.16, respectively. The system precision was performed by three standard solutions had an %RSD of 0.14, 0.09 and 0.12. The limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) were 0.008 and 0.02 μg/mL, respectively. The emodin from Ventilago denticulata was studied in different solvents; water, 20-100% methanol, 20-100% ethanol, 1-propanol and 1-butanol, by maceration for seven days. The results showed that using 60% ethanol as an extraction solvent provided the highest emodin content. In terms of the microwave-assisted extraction, the optimal conditions were microwave power of 600 watts, a three-extraction cycle and 30 seconds of extraction time.

วิธีวิเคราะห์สารอิโมดินจากสารสกัดเถาวัลย์เหล็กด้วยเทคนิค HPLC ได้พัฒนาขึ้นโดยใช้คอลัมน์ XSelect CSH ชนิด C18 ขนาดอนุภาค 5 ไมโครเมตร ขนาด 4.6x250 มิลลิเมตร อุณหภูมิคอลัมน์ 30 องศาเซลเซียส สารละลายตัวพาเป็นสารละลายกรดฟอสฟลอริก ความเข้มข้นร้อยละ 0.1 และ อะเซโทไนไทรล์ผสมกันแบบเกรเดียน อัตราการไหล 1.0 มิลลิลิตรต่อนาที และตรวจวัดด้วยโฟโตไดโอดแอเรย์ที่ความยาวคลื่น 288 นาโนเมตร อิโมดินให้พีคที่เวลาประมาณ 10.8 นาที โดยใช้เวลาวิเคราะห์ 20 นาทีต่อการฉีดแต่ละครั้ง พบว่าวิธีมีความจำเพาะเจาะจงกับอิโมดินสามารถแยกออกจากพีคข้างเคียงได้ ช่วงความเข้มข้นที่นำไปสร้างเส้นกราฟมาตรฐานความสัมพันธ์ระหว่างปริมาณอิโมดินและพื้นที่ใต้พีค พบว่าเป็นสัดส่วนโดยตรงตลอดช่วง 1 ถึง 10 ไมโครกรัมต่อมมิลลิลิตร มีค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ 0.999 การทดสอบความถูกต้องของวิธีแสดงด้วยค่าร้อยละการกลับคืนของอิโมดินที่ 3 ระดับความเข้มข้น 1.8, 3.5 และ 5.5 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร เท่ากับร้อยละ 101.99, 102.44 และ 103.16 ตามลำดับ การทดสอบความแม่นของระบบด้วยสารละลายมาตรฐาน 3 ตัวอย่าง มีค่าร้อยละของค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์เท่ากับ 0.14, 0.09 และ 0.12 ปริมาณต่ำสุดของสารที่สามารถตรวจพบได้เท่ากับ 0.008 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร และปริมาณต่ำสุดของสารที่สามารถตรวจหาเชิงปริมาณได้เท่ากับ 0.02 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร การศึกษาปริมาณอิโมดินจากสารสกัดเถาวัลย์เหล็กโดยใช้ตัวทำละลายต่างชนิดกัน ได้แก่ น้ำ, เมธานอลความเข้มข้นร้อยละ 20-100, เอธานอลความเข้มข้นร้อยละ 20-100, โพรพานอล และ บิวธานอล ด้วยวิธีการหมักเป็นเวลา 7 วัน พบว่าตัวทำละลายที่สกัดอิโมดินออกมาได้ดีที่สุดคือ เอธานอลความเข้มข้นร้อยละ 60 และสภาวะที่เหมาะของการสกัดด้วยไมโครเวฟ คือกำลังของไมโครเวฟ 600 วัตต์ จำนวนรอบการสกัด 3 รอบ และระยะเวลาในการสกัดรอบละ 30 วินาที