DEVELOPMENT OF A NEW COLORIMETRIC METHODFOR DETERMINATION OF FOLIC ACID

Abstract

Folic acid is a member of the water-soluble B vitamin family. It plays an essential role in human life, including supporting DNA replication, power generation and erythropoiesis. It can be used to indicate abnormalities, such as anemia and neural tube defects in babies. This research aims to develop a method for the determination of folic acid using the colorimetric technique and with a transparency sheet-based analytical device. This research was divided into two parts, depending on the reagent and mechanism; the first part is based on the reaction between folic acid and potassium ferricyanide in the presence of Fe (III). The mechanism was related to the reduction of Fe (III) ion to Fe (II) ion by folic acid followed by potassium ferricyanide to form a Prussian blue product. The color of the solution changed from yellow to blue-green and seen by the naked eye. The quantified folic acid concentration was calculated using color intensity by the ImageJ program. Moreover, all parameters affected analytical performance, such as the concentrations of solvents and reagents, sequences for adding solutions and the reaction times. Under optimal conditions, the linearity was from 10 to 100 µg/mL, with a correlation coefficient of 0.9946 and detection limit of 2 µg/mL. The second part was the reaction between potassium ferricyanide, ferric chloride and colloidal silver nanoparticles (AgNPs) to produce the Prussian blue complex. After that, the color changed from blue-green to colorless in the presence of folic acid. Under optimal conditions, the calibration graph for this method was linear over a concentration range from 50 to 300 µg/mL (R2 = 0.9946) and the detection limit of folic acid was found to be 10 µg/mL. This method provides less sensitivity, offers a fast analysis time and increased selectivity. Therefore, this method could be an alternative way to determine a high content folic acid in the samples. In addition, these proposed methods were successfully applied to determine the amount of folic acid in folic acid tablets. The recoveries were obtained in the range of 91.89-110.83%, indicating that developed methods are applicable for folic acid in samples.

กรดโฟลิกเป็นหนึ่งในกลุ่มวิตามินบีที่มีความจำเป็นต่อร่างกายมนุษย์สำหรับนำมาใช้ในกระบวนการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ การสร้างพลังงาน และยังจำเป็นต่อการสร้างเซลล์เม็ดเลือดแดง อีกทั้งยังสามารถบ่งชี้ความผิดปกติของร่างกายได้ เช่น การเกิดภาวะโลหิตจาง และภาวะหลอดประสาทไม่ปิดในทารก จากความสำคัญที่กล่าวมานั้น งานวิจัยนี้จึงมุ่งเน้นการพัฒนาวิธีการตรวจวัดปริมาณกรดโฟลิกด้วยเทคนิคเชิงสีร่วมกับอุปกรณ์ตรวจวัดฐานแผ่นใส โดยงานวิจัยแบ่งออกเป็น 2 ส่วนตามชนิดของรีเอเจนต์และกลไกการทำให้เกิดปฏิกิริยาการเปลี่ยนสี โดยวิธีการวิเคราะห์แรกเป็นการตรวจวัดปริมาณกรดโฟลิกโดยอาศัยการเปลี่ยนแปลงสีของสารละลาย จากปฏิกิริยาระหว่างกรดโฟลิกและสารละลายโพแทสเซียมเฟอริไซยาไนด์ในสภาวะที่มีสารละลายเฟอร์ริคคลอไรด์ โดยกรดโฟลิกจะทำหน้าที่เป็นตัวรีดิวซ์ (Reducing agent) ทำให้ไอออนเหล็ก (III) เปลี่ยนเป็นไอออนเหล็ก (II) จากนั้นไอออนเหล็ก (II) จะทำปฏิกิริยากับสารละลายโพแทสเซียมเฟอริไซยาไนด์เกิดเป็นสารประกอบเชิงซ้อนปรัสเซียนบลู (Prussian blue) ทำให้สารละลายเปลี่ยนสีจากสีเหลืองเป็นสีฟ้าอมเขียวซึ่งสามารถสังเกตได้ด้วยตาเปล่า จากนั้นทำการวิเคราะห์ปริมาณกรดโฟลิกโดยการวัดความเข้มสีด้วยโปรแกรมอิมเมจเจ ทั้งนี้ได้ทำการศึกษาสภาวะที่เหมาะสมในการเกิดปฏิกิริยา ได้แก่ ความเข้มข้นของตัวทำละลาย ความเข้มข้นของรีเอเจนต์ ลำดับการหยดสารละลาย และระยะเวลาในการเกิดปฏิกิริยา พบว่าสามารถวิเคราะห์ปริมาณกรดโฟลิกได้ในช่วงความเข้มข้น 10-100 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร (R2 = 0.9946) มีค่าขีดจำกัดในการตรวจวัดเท่ากับ 2 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ในส่วนของวิธีการวิเคราะห์ที่สองเป็นการตรวจวัดปริมาณกรดโฟลิกโดยอาศัยการฟอกจางสีของสารละลาย จากปฏิกิริยาการเกิดสารประกอบเชิงซ้อนปรัสเซียนบลูระหว่างโพแทสเซียมเฟอริไซยาไนด์ เฟอร์ริกคลอไรด์ และอนุภาคแขวนลอยนาโนเงิน โดยเมื่อเติมกรดโฟลิกลงไปพบว่าสีของสารประกอบเชิงซ้อนปรัสเซียนบลูจะถูกฟอกจางเมื่อเปรียบเทียบกับการไม่เติมกรดโฟลิก ภายใต้สภาวะที่เหมาะสม พบว่า สามารถวิเคราะห์ปริมาณกรดโฟลิกได้ในช่วงความเข้มข้น 50-300 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร (R2 = 0.9975) มีค่าขีดจำกัดในการตรวจวัดเท่ากับ 10 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ถึงแม้วิธีที่สองจะให้ค่าขีดจำกัดในการตรวจวัดที่สูงกว่าวิธีแรกแต่ใช้เวลาในการวิเคราะห์สั้นลงและมีความจำเพาะเจาะจงที่สูงขึ้น จึงเป็นทางเลือกหนึ่งที่น่าสนใจสำหรับการวิเคราะห์ปริมาณกรดโฟลิกในตัวอย่างที่มีปริมาณสูง นอกจากนี้วิธีการวิเคราะห์ทั้งสองยังประสบความสำเร็จในการนำไปประยุกต์ใช้เพื่อตรวจวิเคราะห์ปริมาณกรดโฟลิกในตัวอย่างเม็ดยา โดยมีค่าร้อยละการคืนกลับอยู่ในช่วง 91.89 – 110.83% ซึ่งแสดงว่า วิธีที่พัฒนานี้สามารถยอมรับและนำไปใช้สำหรับการวิเคราะห์ปริมาณกรดโฟลิกในตัวอย่างได้