ACETYLCHOLINESTERASE INHIBITORY AND ANTIOXIDANT ACTIVITIES OF SUK SAI-YAD HERBAL REMEDY EXTRACTS AND QUALITY CONTROL BY LIQUID CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY

Abstract

This study aims to investigate the acetylcholinesterase inhibitory activity and antioxidant effects of the Suksaiyad herbal remedy, as well as develop methods for analyzing delta-9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC) and cannabidiol (CBD) in the Suksaiyad remedy, that includes cannabis leaves, using liquid chromatography-mass spectrometry techniques. The method development results showed a linear concentration range of 0.005–20 µg/ml with R > 0.9999. The limit of quantitation (LOQ) for Δ9-THC and CBD was 0.9706 and 0.3973 ng/ml, respectively, using an injection volume of 0.1 µl. The accuracy of the instrument and method, reported as average % recovery, ranged from 98.98% to 103.72%. The precision, reported as % RSD, ranged from 0.59% to 2.09% for intra-day and from 1.09% to 2.06% for inter-day. No interference from other components in the Suksaiyad remedy was found. The extraction of the Suksaiyad remedy from seven sources yielded crude extract amounts ranging from 3.12% to 33.89%. Analysis of Δ9-THC and CBD content in 30 grams of crude extract containing 4.61 grams (15.38%) of cannabis leaves showed CBD content ranging from 0.00002% to 0.01541% and Δ9-THC content ranging from 0.00231% to 0.14218%, which does not exceed the legal limit of 0.2%. The acetylcholinesterase inhibitory activity of the Suksaiyad remedy dichloromethane extract, tested using Ellman's method, showed an IC50 value of 1.34 mg/ml. The antioxidant activity, tested using the DPPH scavenging assay, showed that the dichloromethane and ethanol extracts had antioxidant effects, with IC50 values of 153.93 µg/ml and 16.76 µg/ml, respectively. The molecular docking study of the interactions between key compounds in the Suksaiyad formula and acetylcholinesterase enzyme (PDB: 7E3H) using AutoDock Vina software indicated that piperine and dehydropipernonaline, which follows Lipinski's rule of five and crosses the blood-brain barrier, had the best binding energy at -10.5 kcal/mol. This was followed by Δ9-THC and piperdardine with binding energies of -10.3 kcal/mol, and N-trans-coumaroyltyramine with a binding energy of -10.2 kcal/mol. These compounds showed Pi-Pi stacking interactions with amino acids at positions TRP 86A, TRP 286A, and TYR 341A, similar to the binding site of Donepezil, a drug used to treat Alzheimer's disease, which had a binding energy of -11.7 kcal/mol. Therefore, the key compounds in the Suksaiyad formula have potential for development as drugs for treating Alzheimer's disease.

งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาฤทธิ์การยับยั้งเอนไซม์อะซิทิลโคลีนเอสเทอเรสและฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระในตำรับยาศุขไสยาศน์ รวมถึงการพัฒนาวิธีวิเคราะห์สารเตตราไฮโดรแคนนาบินอล และสารแคนนาบิไดออลในตำรับยาศุขไสยาศน์ ซึ่งมีส่วนผสมของใบกัญชา โดยใช้เทคนิคลิควิดโครมาโทกราฟี-แมสส์สเปกโทรเมตรี ผลการพัฒนาวิธีวิเคราะห์ พบว่า ช่วงการวิเคราะห์ที่ให้ความเป็นเส้นตรง เท่ากับ 0.005 ถึง 20 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร มีค่า R > 0.9999 โดยสารเตตราไฮโดรแคนนาบินอลมีและแคนนาบิไดออลมีขีดจำกัดต่ำสุดของการวิเคราะห์ปริมาณเท่ากับ 0.9706 และ 0.3973 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร ตามลำดับ โดยใช้ปริมาตรในการวิเคราะห์ 0.1 ไมโครลิตร ผลการทดสอบความแม่น อยู่ในช่วง 98.98 % ถึง 103.72 % มีค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ (%RSD) ในวันเดียวกัน (intra-day)อยู่ในช่วง 0.59 % ถึง 2.09 % และต่างวัน อยู่ในช่วง 1.09 % ถึง 2.06 % และไม่พบการรบกวนขององค์ประกอบอื่น ๆ ในตำรับยา การสกัดสารตำรับศุขไสยาศน์ ากแหล่งต่าง ๆ จำนวน 7 แหล่ง ให้ร้อยละผลผลิต (%yield) อยู่ในช่วง 3.12% ถึง 33.89% การวิเคราะห์ปริมาณเตตราไฮโดรแคนนาบินอลและแคนนาบิไดออลในตำรับยาศุขไสยาศน์ 30 กรัม ซึ่งประกอบด้วยใบกัญชา 4.61 กรัม (15.38%) ตรวจพบปริมาณแคนนาบิไดออล ในใบกัญชา ช่วง 0.00002 ถึง 0.01541% และปริมาณเตตราไฮโดรแคนนาบินอล ในใบกัญชา ช่วง 0.00231 ถึง 0.14218% ซึ่งไม่เกิน 0.2% ตามที่กฎหมายกำหนด เมื่อทำการทดสอบฤทธิ์การยับยั้งเอนไซม์อะซิทิลโคลีนเอสเทอเรสของสารสกัดตำรับยาศุขไสยาศน์ ด้วยวิธี Ellman's method พบว่า มีค่า IC50 เท่ากับ 1.34 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร และเมื่อทำการทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดตำรับยาศุขไสยาศน์ด้วยวิธี DPPH scavenging assay ในชั้นตัวทำละลายไดคลอโรมีเทนและชั้นตัวทำละลายเอทานอล มีค่า IC50 เท่ากับ 153.93 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร และ 16.76 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ตามลำดับ การศึกษาจับกันระหว่างโมเลกุลของสารสำคัญในตำรับยาศุขไสยาศน์กับเอนไซม์อะซิทิลโคลีนเอสเทอเรส (PDB: 7E3H) โดยใช้โปรแกรม AutoDock Vina พบว่าสารที่มีการยึดจับกับโปรตีนได้ดีที่สุด คือ piperine และ dehydropipernonaline ซึ่งสอดคล้องกับกฎของ Lipinski's rule of five และสามารถผ่าน blood-brain barrier ได้ มีพลังงานการยึดจับที่ดีที่สุด -10.5 กิโลแคลอรี/โมล รองลงมาคือ Δ9-THC และ piperdardine ค่าพลังงานการยึดจับที่ -10.3 กิโลแคลอรี/โมล และ N-trans-coumaroyltyramine ค่าพลังงานการยึดจับที่ -10.2 กิโลแคลอรี/โมล เกิด Pi-Pi Stacked ระหว่างลิแกนด์กับกรดอะมิโนในตำแหน่ง TRP 86A, TRP 286A และ TYR 341A ซึ่งเกิดตำแหน่งเดียวกับยา Donepezil ที่ให้ค่าพลังงานการยึดจับที่ -11.7 kcal/mol ซึ่งเป็นยาที่ใช้รักษาโรคอัลไซเมอร์ ที่สามารถซึมผ่านเข้าสู่สมอง ดังนั้น สารสำคัญในตำรับยาศุขไสยาศน์จึงมีศักยภาพในการพัฒนาเป็นยาสำหรับรักษาโรคอัลไซเมอร์ได้