THE INVESTIGATION OF THE EFFECTS AND CELLULAR MECHANISMS OF KAEMPFEROL ON REGULATING ION TRANSPORT IN COLONIC EPITHELIUM

Abstract

Kaempferol is a flavonol, mostly found in plants and identified as the most potent stimulator of Cl- secretion in airway epithelial cells. This study aims to investigate the effects and cellular mechanisms of kaempferol on ion transport in colonic epithelial T84 cells. The cytotoxicity of kaempferol on T84 cells was examined by MTT assay. The electrical parameters were measured using the Ussing chamber technique. CFTR protein expression was determined by western blot. The results showed that kaempferol treatments (1, 5, 10, 50, and 100 µM) for 24 and 48 h had no toxicity to T84 cells. In intact monolayers, the apical and basolateral addition of kaempferol exerted a biphasic short circuit current (ISC) response. Concentrations of less than 50 µM induced a concentration-dependent increase in ISC with an EC50 of 8.18 µM whereas high concentration inhibited ISC. Kaempferol (50 µM)-increased ISC was inhibited by CFTR inhibitors (Glibenclamide and NPPB) or NKCC blocker (bumetanide), but not CaCC inhibitors (CaCCinh-A01 and DIDS) or the Na+ channel blocker. The ion substitution tests indicated that kaempferol-increased ISC was dependent on Cl- secretions. In amphotericin B-permeabilized monolayers, kaempferol-stimulated apical Cl- current (ICl) was inhibited by Cl- inhibitors (CFTRinh-172 and CaCCinh-A01). Kaempferol had no additive effects in the presence of forskolin or 8cpt-cAMP. Moreover, kaempferol activated the basolateral K+ current (IKB). The kaempferol-stimulated ICl was decreased by protein kinase A inhibitor (H89) whereas it was not abolished by tyrosine kinase inhibitors (AG490 and tyrphostin A23) or tyrosine phosphatase inhibitor (vanadate). Kaempferol treatment for 24 h increased CFTR protein expression. Conclusively, kaempferol activates Cl- secretion through activating apical Cl- current and basolateral K+ current in T84 cells. Its mechanism may involve the cAMP/PKA pathway along with increasing CFTR protein expression. The findings indicated the therapeutic benefit of using kaempferol to promote fluid secretion into the intestinal lumen which can be used to treat constipation.

แคมเฟอรอลเป็นสารฟลาโวนอลชนิดหนึ่งที่พบมากในพืชและถูกระบุว่าเป็นตัวกระตุ้นการหลั่งคลอไรด์ที่มีฤทธิ์แรงมากที่สุดในเซลล์เยื่อบุผิวทางเดินหายใจ การศึกษานี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาฤทธิ์และกลไกการออกฤทธิ์ระดับเซลล์ของแคมเฟอรอลต่อการขนส่งไอออนในเซลล์เยื่อบุผิวลำไส้ใหญ่ ที84 โดยตรวจสอบความเป็นพิษของแคมเฟอรอลต่อเซลล์ที84 ด้วยวิธีเอ็มทีที ทดสอบผลต่อค่าทางไฟฟ้าโดยใช้เทคนิคอุสซิ่งแชมเบอร์ และผลต่อการแสดงออกของโปรตีนซีเอฟทีอาร์โดยวิธีเวสเทิร์นบลอท ผลการทดลองพบว่าการใช้แคมเฟอรอลทที่ความเข้มข้น 1, 5, 10, 50, และ 100 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลา 24 และ 48 ชั่วโมง ไม่มีความเป็นพิษต่อเซลล์ที84 การใส่แคมเฟอรอลไปยังส่วนปลายยอดและส่วนฐานของเซลล์ชั้นเดียวในสภาพสมบูรณ์ทำให้เกิดการตอบสนองของกระแสวงจรสั้นเป็น 2 แบบ ความเข้มข้นที่น้อยกว่า 50 ไมโครโมลาร์ กระตุ้นให้กระแสวงจรสั้นเพิ่มขึ้นตามความเข้มข้น ด้วยค่าความเข้มข้นที่มีประสิทธิผลสูงสุดครึ่งหนึ่งที่ 8.18 ไมโครโมลาร์ ในขณะที่ความเข้มข้นสูงกว่านั้นยับยั้งกระแสวงจรสั้น กระแสวงจรสั้นที่ถูกกระตุ้นโดยแคมเฟอรอล 50 ไมโครโมลาร์ ถูกยับยั้งได้โดยสารยับยั้งช่องขนส่งคลอไรด์ชนิดซีเอฟทีอาร์ ไกลเบนคลาไมด์ และเอ็นพีพีบี หรือสารยับยั้งตัวขนส่งร่วมโซเดียมโพแทสเซียมคลอไรด์ บูมีทาไนด์ แต่ไม่ถูกยับยั้งได้โดยสารยับยั้งช่องขนส่งคลอไรด์ชนิดแคลเซียม ซีเอซีซี-เอ01 และดีไอดีเอส หรือสารยับยั้งช่องขนส่งโซเดียม การทดสอบการแทนที่ของไอออนบ่งชี้ว่ากระแสวงจรสั้นที่เพิ่มขึ้นโดยแคมเฟอรอลนั้นขึ้นอยู่กับการหลั่งคลอไรด์ การทดสอบในเซลล์ชั้นเดียวที่ซึมผ่านได้โดยใช้แอมโฟเทอริซิน บี พบว่าแคมเฟอรอลที่กระตุ้นกระแสคลอไรด์ถูกยับยั้งได้โดยสารยับยั้งช่องขนส่งคลอไรด์ ซีเอฟทีอาร์-172 และซีเอซีซี-เอ01 นอกจากนี้แคมเฟอรอลไม่มีผลกระตุ้นกระแสคลอไรด์เพิ่มในสภาวะที่มีฟอร์สโคลินหรือ 8 ซีพีที-ไซคลิกเอเอ็มพี อีกทั้งแคมเฟอรอลยังกระตุ้นกระแสโพแทสเซียมได้ ทั้งนี้แคมเฟอรอลที่กระตุ้นกระแสคลอไรด์ถูกทำให้ลดลงได้ด้วยสารยับยั้งโปรตีนไคเนส เอ เอช89 แต่ไม่ใช่ด้วยสารยับยั้งไทโรซีนไคเนส เอจี490 และไทร์ฟอสติน เอ23 หรือสารยับยั้งไทโรซีนฟอสฟาเตส วานาเดต การได้รับแคมเฟอรอลเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ยังช่วยเพิ่มการแสดงออกของโปรตีนซีเอฟทีอาร์ จึงสรุปได้ว่า แคมเฟอรอลกระตุ้นการหลั่งคลอไรด์ผ่านทางการกระตุ้นกระแสคลอไรด์และกระแสโพแทสเซียมในเซลล์เยื่อบุผิวลำไส้ใหญ่โดยกลไกที่อาจเกี่ยวข้องกับไซคลิกเอเอ็มพี/โปรตีนไคเนส เอ และเพิ่มการแสดงออกของโปรตีนซีเอฟทีอาร์ การค้นพบของเรานี้ชี้ให้เห็นว่าแคมเฟอรอลช่วยส่งเสริมการหลั่งของเหลวในช่องลำไส้ซึ่งสามารถนำไปใช้เพื่อรักษาอาการท้องผูก