OPTIMIZATION OF BIOACTIVE COMPOUNDS PRODUCTION FROM PSEUDOMONAS AERUGINOSA SWUC02 AND ITS GENOME SEQUENCES ANALYSIS FOR HOUSEHOLD STAPHYLOCOCCUS AUREUS INHIBITION

Abstract

Staphylococcus aureus is an opportunistic pathogen that can cause a variety of diseases. There is also the problem of antibiotic resistance in the methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) group, which is necessary to manage these problems. Pseudomonas aeruginosa produces various types of antimicrobial substances. Therefore, the objective of this research is to optimize conditions to produce antimicrobial compounds from P. aeruginosa SWUC02 for inhibiting S. aureus, it also aims to study the characteristics of antimicrobial compounds from P. aeruginosa SWUC02. This study also aims to evaluate the efficacy of the extract from P. aeruginosa SWUC02 in inhibiting household MRSA. With dual culture and well-diffusion assays, P. aeruginosa SWUC02 inhibited the growth of various common pathogenic bacterial strains. Furthermore, the cell-free culture of P. aeruginosa SWUC02 exhibited the highest inhibition against both S. aureus and Bacillus cereus. According to whole-genome sequencing analysis, P. aeruginosa SWUC02 had 16 gene clusters related to the production of antimicrobial compounds, classified into three groups: bacteriocins, metabolites, and siderophores. The one-factor-at-a-time method was used to optimize the culture conditions for P. aeruginosa. This was achieved by culturing the bacteria in LB or TSB nutrient media supplemented with 0.01% CuCl2, starting with an initial inoculum size of 1x105 CFU.ml-1, at a pH of 7, shaking at 100 rpm, and incubating at 32°C for 12 days. The antimicrobial compounds in the cell-free culture of P. aeruginosa SWUC02 were tolerant to pepsin, proteinase K, and heat and could be extracted using dichloromethane. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of the cell-free culture and the extract against S. aureus were 0.098%, 0.391%, and 3.91, 3.91 µg/mL, respectively. The minimum biofilm inhibitory concentration (MBIC) of the extract was 15.625 µg/mL. The MIC of the extract against MRSA isolates ranged from 3.91 to 15.63 µg/mL. The application of the extract on household wash basin reduced total bacteria. However, this study is not able to inhibit the growth of Staphylococcal group. This demonstrates the efficacy of the culture and extract derived from P. aeruginosa SWUC02 in inhibiting bacteria and suggests the potential of the extract for further development into a product for inhibiting bacteria.

Staphylococcus aureus เป็นเชื้อแบคทีเรียก่อโรคฉวยโอกาส ที่มีความสามารถในการก่อโรคได้หลากหลายชนิด นอกจากนี้ยังมีปัญหาการดื้อยาของเชื้อในกลุ่ม methicillin–resistance S. aureus (MRSA) จึงมีความจำเป็นที่จะต้องหาวิธีในการจัดการกับปัญหาเหล่านี้ จากการศึกษาก่อนหน้า Pseudomonas aeruginosa เป็นแบคทีเรียที่มีความสามารถในการผลิตสารยับยั้งจุลินทรีย์ได้หลากหลายชนิด ดังนั้นงานวิจัยนี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาสภาวะที่เหมาะสมของการเลี้ยง P. aeruginosa สำหรับการผลิตน้ำเลี้ยงเชื้อที่มีประสิทธิภาพในการยับยั้ง S. aureus ประเมินประสิทธิภาพของสารสกัดจากน้ำเลี้ยงเชื้อ P. aeruginosa SWUC02 ในการประยุกต์ใช้ยับยั้ง MRSA สายพันธุ์ที่พบในครัวเรือน จากการศึกษาความสามารถในการยับยั้งแบคทีเรียของเชื้อและน้ำเลี้ยงเชื้อ P. aeruginosa SWUC02 พบว่า P. aeruginosa SWUC02 สามารถยับยั้งเชื้อแบคทีเรียได้หลากหลายชนิด และน้ำเลี้ยงเชื้อสามารถยับยั้ง S. aureus และ Bacillus cereus ได้ดีที่สุด ผลจากการวิเคราะห์โดยวิธี whole–genome sequencing พบว่า P. aeruginosa SWUC02 มีกลุ่มยีนที่เกี่ยวกับการสร้างแบคทีริโอซิน, สารเมแทบอไลท์ทุติยภูมิ, และ ซิเดอร์โรฟอร์ ทั้งหมด 16 กลุ่มยีน การศึกษาสภาวะที่เหมาะสมต่อการเลี้ยง P. aeruginosa SWUC02 เพื่อใช้ในการผลิตสารยับยั้งจุลินทรีย์ด้วยวิธี one–factor at a time พบว่าสภาวะที่เหมาะสมต่อการเลี้ยง P. aeruginosa SWUC02 เพื่อผลิตสารปฏิปักษ์คือเลี้ยงด้วยอาหาร LB หรือ TSB ที่มี 0.01% CuCl2, pH 7, มีปริมาณเชื้อเริ่มต้นที่ 1×105 CFU.ml-1, เขย่าที่ความเร็วรอบ 100 rpm และอุณหภูมิ 32 องศาเซลเซียส นาน 12 วัน โดยพบว่าลักษณะของสารออกฤทธิ์ในน้ำเลี้ยงเชื้อมีความสามารถในการทนต่อ pepsin proteinase K และความร้อน สารออกฤทธิ์ดังกล่าวถูกสกัดด้วย dichloromethane ได้มากที่สุด ความเข้มข้นที่ต่ำที่สุดที่สามารถยับยั้ง (MIC) และทำลาย (MBC) S. aureus ได้ของน้ำเลี้ยงเชื้อและสารสกัดจากน้ำเลี้ยงเชื้อ คือ 0.098%, 0.391% และ 3.91, 3.91 µg/mL ตามลำดับ ความเข้มข้นที่ต่ำที่สุดที่สามารถยับยั้งไบโอฟิล์ม (MBIC) ของสารสกัดจากน้ำเลี้ยงเชื้อคือ 15.625 µg/mL เมื่อนำสารสกัดจากน้ำเลี้ยงเชื้อมาทดสอบกับ MRSA 7 สายพันธุ์ พบว่าสามารถยับยั้งการเจริญของ MRSA ได้โดยมี MIC อยู่ในช่วง 3.91-15.63 µg/mL การประยุกต์ใช้สารสกัดจากน้ำเลี้ยงเชื้อ P. aeruginosa SWUC02 ในการยับยั้ง S. aureus ที่พื้นผิวบนอ่างล้างมือครัวเรือน พบว่าสารสกัดจากน้ำเลี้ยงเชื้อมีความสามารถในการยับยั้งแบคทีเรียได้อย่างมีประสิทธิภาพแต่ไม่สามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อในกลุ่ม staphylococcal ได้ จากการศึกษาในครั้งนี้แสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพของน้ำเลี้ยงเชื้อและสารสกัดจากน้ำเลี้ยงเชื้อ P. aeruginosa SWUC02 ในการยับยั้ง MRSA อีกทั้งยังสามารถยับยั้งการเกิดไบโอฟิล์มของ S. aureus ซึ่งแสดงถึงความเป็นไปได้ในการนำไปประยุกต์ใช้หรือพัฒนาเป็นผลิตภัณฑ์สำหรับยับยั้งจุลินทรีย์