INHIBITION OF PSEUDOMONAS SPP. PRODUCING HEAT-RESISTANT PROTEASEIN MILK BY BACTERIOPHAGES

Abstract

Phage-based biocontrol is an alternative method for preventing and controlling spoilage in dairy products. Milk spoilage is often caused by Pseudomonas, which are predominant in raw milk. These bacteria are psychrotrophic and can produce heat-resistant protease that degrades casein proteins, leading to spoilage in heat-treated milks. This study aims to isolate Pseudomonas strains from milk and examine their ability to produce heat-stable protease. The genes aprX and enzyme activity of the isolated strains were also investigated. The study showed that 14 Pseudomonas strains were capable of producing protease and possessed the aprX gene. All strains were used as hosts for phage isolation, resulting in three phages, namely ΦC106, Φ21A, and Φ1887, which could infect P. mosselii C24, P. mosselii N1, and P. fluorescens TISTR 1887, respectively. Transmission electron microscopy revealed that ΦC106 and Φ21A belonged to the Podoviridae family, while Φ1887 belonged to the Myoviridae family. Phages ΦC106 and Φ21A had a broad host range against Pseudomonas strains.The optimal multiplicity of infection (MOI) of ΦC106 and Φ21A was 10. The one-step growth curve analysis of both phages showed that ΦC106 and Φ21A have a latent period of 20 minutes and burst sizes calculated to be 1,862 and 331 PFUs/infected cells, respectively. These phages are stable over a wide range of pH and temperature. In vitro lytic activity and proteolytic activity of phages ΦC106 and Φ21A against P. mosselii C24 revealed both individual phages and phage cocktail were able to reduce the number of bacterial cells by 4-5 log CFU/ml and reduce the activity of protease by 0.01 unit. The complete genome of P. mosselii C24 comprises one circular chromosome with a length of 5,754,740 and encodes a variety of protease genes. In addition, phage ΦC106 and Φ21A genomes consist of linear double-stranded with a length of 36,127 and 39,716 bp, respectively. Neither phage was found to have ORFs encoding toxin proteins, antibiotic-resistant genes (ARGs), virulence factors (VFs) of bacterial origin, or genes necessary for the lysogenic cycle, indicating that both phages are virulent phages and can control P. mosselii spoilage. This study indicated that the phages are efficient in controlling the prevalence of spoilage-causing P. mosselii strains in dairy and food-related environments.

การยับยั้งเชื้อแบคทีเรียโดยอาศัยเฟจถือเป็นอีกทางเลือกหนึ่งในการป้องกันและควบคุมการเน่าเสียในผลิตภัณฑ์นม โดยสาเหตุของการเน่าเสียในนมมักเกิดจากเชื้อในกลุ่ม Pseudomonas ซึ่งเป็นแบคทีเรียทนเย็นที่มักพบการปนเปื้อนในนมดิบมากที่สุด โดยเชื้อสามารถสร้างเอนไซม์โปรติเอสทนร้อนที่ทำให้เกิดการย่อยสลายโปรตีนเคซีนในนมที่ผ่านการความร้อน ทำให้นมเกิดการเน่าเสีย การศึกษานี้ได้คัดแยกแบคทีเรีย Pseudomonas จากนมและนำมาศึกษาความสามารถในการสร้างเอนไซม์โปรติเอส การตรวจสอบยีนที่เกี่ยวข้องได้แก่ ยีน aprX และกิจกรรมของเอนไซม์ที่เชื้อสร้างขึ้น จากการศึกษาพบว่า สามารถแยกเชื้อ Pseudomonas ที่สร้างเอนไซม์โปรติเอสและตรวจพบยีน aprX ได้ 14 สายพันธุ์ โดยทุกสายพันธุ์จะถูกใช้เป็นโฮสต์ในการคัดแยกเฟจ โดยสามารถคัดแยกเฟจได้ 3 ตัว ได้แก่ ΦC106, Φ21A และ Φ1887 เมื่อใช้เชื้อ P. mosselii C24, P. mosselii N1 และ P. fluorescens TISTR 1887 เป็นโฮสต์ ตามลำดับ การศึกษารูปร่างของเฟจภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านแสดงให้เห็นว่าเฟจ ΦC106 และ Φ21A จัดอยู่ในแฟมิลี Podoviridae และ เฟจ Φ 1887 จัดอยู่ในแฟมิลี Myoviridae โดยเฟจ ΦC106 และ Φ21A มีความสามารถในการติดเชื้อ Pseudomonas ได้มากที่สุด อัตราส่วนของเฟจต่อโฮสต์ที่เหมาะสมในการติดเชื้อของเฟจ ΦC106 และ Φ21A เท่ากับ 10 จากกราฟการเจริญของเฟจแสดงให้เห็นว่าเฟจ ΦC106 และ Φ21A มีช่วง latent period เท่ากับ 20 นาที และ burst sizes เท่ากับ 1,862 และ 331 PFUs/infected cells ตามลำดับ โดยเฟจ ΦC106 and Φ21A มีความเสถียรต่อ pH และอุณหภูมิในช่วงกว้าง จากผลการศึกษาการยับยั้งเชื้อ P. mosselii C24 และกิจกรรมของเอนไซม์โปรติเอส โดยเฟจ ΦC106 และ Φ21A ในรูปแบบเดี่ยวและแบบผสม พบว่าสามารถลดจำนวนเชื้อแบคทีเรียได้มากที่สุดเท่ากับ 4-5 log CFU/ml และสามารถลดกิจกรรมเอนไซม์โปรติเอสได้มากที่สุดเท่ากับ 0.01 unit ซึ่งแสดงให้เห็นว่าเฟจทั้งสองตัวมีประสิทธิภาพในการควบคุม P. mosselii ที่เป็นสาเหตุในการเน่าเสียในผลิตภัณฑ์นม และจากการศึกษาลำดับจีโนมทั้งหมดของ P. mosselii C24 พบว่าโครโมโซมมีความยาว 5,754,740 คู่เบส และพบยีนที่แสดงออกเป็นเอนไซม์โปรติเอสที่หลากหลาย สำหรับลำดับจีโนมทั้งหมดของเฟจ ΦC106 และ Φ21A พบว่าเป็นดีเอ็นเอเส้นตรงสายคู่ มีความยาว 36,127 คู่เบส และ 39,716 คู่เบส ตามลำดับ โดยเฟจทั้งสองดังกล่าวไม่พบ ORF ที่แสดงออกเป็นโปรตีน toxin, virulence factor และยีนต้านยาปฏิชีวนะ รวมถึงไม่พบกลุ่มยีนที่จำเป็นใน lysogenic cycle แสดงให้เห็นว่า เฟจทั้งสองตัวจัดเป็น virulent phage และสามารถนำไปใช้ควบคุมเชื้อ P. mosselii ที่ทำให้เกิดการเน่าเสียในนมได้อย่างปลอดภัย