CHARACTERIZATION OF LYTIC BACTERIOPHAGES AND THEIR APPLICATION IN CONTROLLING AEROMONAS DHAKENSIS

Abstract

Aeromonas dhakensis is the most virulent Aeromonas species in tropical and subtropical areas and causes a variety of human diseases. Due to antibiotic resistance, there is an urgent need for new strategies against this pathogen. This is the first study to isolate and characterize lytic phages against A. dhakensis and of Aeromonas isolates, only isolate AM could isolate phages using enrichment techniques. This strain was identified via biochemical tests, 16S rDNA sequencing, and whole-genome analyses. All of the results confirmed that strain AM was A. dhakensis. In silico detection of antimicrobial resistance genes and virulence factors corresponded to the main bacterial virulence determinants observed in A. dhakensis AM, and used as a host for phage isolation. The four lytic phages, designated vB_AdhS_TS3, vB_AdhM_TS9, vB_AdhM_DL, and vB_AdhS_M4, were isolated. The transmission electron micrographs showed that vB_AdhS_TS3 and vB_AdhS_M4 belonged to Siphoviridae, whereas vB_AdhM_TS9 and vB_AdhM_DL belonged to Myoviridae family. The host-range determination demonstrated all phages were capable of infecting A. dhakensis. The three phages, vB_AdhS_TS3, vB_AdhM_TS9, and vB_AdhM_DL, were selected for a shorter latency period and larger burst sizes. All phages were resistant to a wide range of pH values and stable after a 60-minute incubation at 4°C, 25°C, 30°C, and 37°C, but sensitive to higher temperatures. The pre-treatment (co-inoculation of A. dhakensis and phage) with individual phages and cocktails reduced bacterial numbers in 2.82-6.67 and 5.19-5.43 Log CFU/mL, after 6 h of incubation. In post-treatment, maximum inactivation was the log reduction of bacterial numbers in the range of 3.06-5.25 and 4.01-6.49 Log CFU/mL after 6 and 12 h of incubation. A combination of phage cocktail with amoxicillin at sub-MIC showed inactivation in pre-treatment and post-treatment at 200 µL. However, incomplete inhibition was observed in post-treatment at 20 mL but still decreased by 1.2-1.7 log CFU/mL when compared to the control and after incubation for 48 h. The complete genome and G+C content of phages vB_AdhS_TS3, vB_AdhM_DL, and vB_AdhM_TS9 were 115,560, 61,429, and 115,503 bp, with G+C contents of 41.10%, 61.7%, and 35.34%. This study demonstrated using phages as an adjuvant with a sublethal concentration of antibiotics as an effective therapeutic strategy.

Aeromonas dhakensis ถือเป็นสปีชีส์ที่มีความรุนแรงที่สุดในเชื้อ Aeromonas ซึ่งมักพบในแถบพื้นที่เขตร้อน และกึ่งเขตร้อน อีกทั้งยังเป็นสาเหตุที่ทำให้เกิดโรคต่าง ๆ ในมนุษย์ เนื่องจากเชื้อชนิดนี้ดื้อต่อยาปฏิชีวนะบางชนิด จึงมีความจำเป็น ที่จะหาวิธีการใหม่ ๆ ในการยับยั้งเชื้อชนิดนี้อย่างเร่งด่วน งานวิจัยนี้เป็นงานวิจัยแรกที่ทำการคัดแยกและศึกษาลักษณะของ ไลติคเฟจของเชื้อ A. dhakensis โดยงานวิจัยนี้ได้ใช้ไอโซเลท AM ในการคัดแยกและเพิ่มจำนวนเฟจ จากการจัดจำแนก สายพันธุ์เชื้อโดยการทดสอบทางชีวเคมี ศึกษาหาลำดับเบสบริเวณ 16S rDNA และศึกษาจีโนมทั้งหมดของเชื้อ พบว่า ไอโซเลท AM จัดเป็นเชื้อ A. dhakensis จากการวิเคราะห์ยีนพบตำแหน่งยีนดื้อยาปฏิชีวนะและยีนที่เกี่ยวข้อง กับความรุนแรงในเชื้อ A. dhakensis AM จากนั้นได้นำเชื้อนี้มาใช้เป็นโฮสต์ในการคัดแยกเฟจ โดยสามารถคัดแยกเฟจ ได้ 4 ตัว ได้แก่ vB_AdhS_TS3, vB_AdhM_TS9, vB_AdhM_DL และ vB_AdhS_M4 จากการศึกษารูปร่างของเฟจ ภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านแสดงให้เห็นว่าเฟจ vB_AdhS_TS3 และ vB_AdhS_M4 จัดอยู่ใน family Siphoviridae ในขณะที่เฟจ vB_AdhM_TS9 และ vB_AdhM_DL จัดอยู่ใน family Myoviridae การศึกษาความสามารถ ของเฟจในการติดเชื้อสายพันธุ์อื่นแสดงให้เห็นว่า เฟจทั้ง 4 ตัว มีความจำเพาะในการติดเชื้อ A. dhakensis เท่านั้น ต่อมาได้คัดเลือกเฟจ 3 ตัว ได้แก่ vB_AdhS_TS3, vB_AdhM_TS9 และ vB_AdhM_DL ในการศึกษาต่อไป เนื่องจากมีระยะ latent ที่สั้นและมีค่า burst size ที่มาก โดยเฟจทุกตัวมีความเสถียรต่อ pH และอุณหภูมิ 4, 25, 30 และ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 60 นาที และจะไวต่อการเสียสภาพเมื่ออุณหภูมิที่สูงขึ้น จากการทดสอบการยับยั้งเชื้อแบบ pre-treatment โดยใช้เฟจแบบเดี่ยวและเฟจแบบผสมพบว่า ภายหลังจากบ่ม 6 ชั่วโมง สามารถลดปริมาณเชื้อ 2.82-6.67 และ 5.19-5.43 Log CFU/mL ตามลำดับ ในการทดสอบการยับยั้งเชื้อแบบ post-treatment โดยใช้เฟจแบบเดี่ยวและเฟจแบบผสม พบว่า ภายหลังจากบ่ม 6 และ 12 ชั่วโมง พบการยับยั้งเชื้อสูงสุด 3.06-5.25 และ 4.01-6.49 Log CFU/mL ตามลำดับ จากการ ทดสอบการยับยั้งเชื้อโดยใช้เฟจร่วมกับยา amoxicillin ในระดับ sub-MIC แสดงให้เห็นการยับยั้งเชื้ออย่างสมบูรณ์ทั้งใน การยับยั้งเชื้อแบบ pre-treatment และแบบ post-treatment ในปริมาตร 200 ไมโครลิตร อย่างไรก็ตาม การยับยั้งเชื้อเกิด ไม่สมบูรณ์ในชุดการทดลองแบบ post-treatment ในปริมาตร 20 มิลลิลิตร แต่ยังคงลดปริมาณเชื้อประมาณ 1.2-1.7 Log CFU/mL เมื่อเปรียบเทียบกับชุดควบคุมและชุดการทดลองอื่น ๆ ภายหลังจากการบ่มเป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากการวิเคราะห์ ลำดับจีโนมทั้งหมดของเฟจและค่า G+C contents ของ vB_AdhS_TS3, vB_AdhM_DL และ vB_AdhM_TS9 พบว่า มีขนาดของจีโนมเท่ากับ 115,560, 42,388 และ 115,503 คู่เบส ตามลำดับ และมีค่า G+C contents 41.10, 61.7 และ 35.34 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ การศึกษานี้แสดงให้เห็นถึงการใช้เฟจในรูปแบบผสมร่วมกับยาปฏิชีวนะในระดับ sublethal เพื่อเป็นทางเลือกในการยับยั้งเชื้อ A. dhakensis อย่างมีประสิทธิภาพ