BIOLOGICAL FUNCTION OF GLY-CYS-RICH REGION AND PRO-ARG-RICH REGIONOF CRUSTINS FROM WHITELEG SHRIMP

Abstract

Crustins are antimicrobial peptides that are important for the shrimp immune system. Their biological activities exhibited the growth inhibition of microorganisms. In the previous research, the Type I and Type II crustins showed the antimicrobial activities against several microorganisms, whereas the Type III crustins had both antimicrobial and antiproteinase activities. In this work, a novel Type I crustin (Lvcarcinin), Type II crustin (CrustinP), Type III crustin (PA-SWD), the WAP domain of the CrustinP (WAP-PV) and WAP domain of PA-SWD (WAP-SWD) from the whiteleg shrimp (Litopenaeus vannamei) were characterized. In addition, the Pro and Arg-rich region of PA-SWD was ligated with WAP-PV (PA-WAP-PV) in order to study the biological activities. The Lvcarcinin, CrustinP, WAP-PV, PA-SWD, WAP-SWD and PA-WAP-PV genes consist of an open reading frame of 336, 438, 163, 210,156 and 217 bp, respectively and encoding a putative protein of 111, 145, 53, 69, 51 and 71 amino acid residues, respectively. After producing these six recombinant proteins using Escherichia coli expression system, the growth inhibition of microorganisms was determined using an agar well diffusion assay. The results showed that the rLvcarcinin could inhibit the growth of Bacillus subtilis. The rCrustinP, rWAP-PV, rPA-SWD, rWAP-SWD and rPA-WAP-PV inhibited the growth of Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus. However, rWAP-PV and rWAP-SWD weakly inhibited the growth compared with rCrustinP and rPA-SWD, respectively. Furthermore, the result of proteinase inhibitory activities showed that the Type III crustin, rPA-SWD and rWAP-SWD, exhibited the inhibition against proteinase K. As a result, the Lvcarcinin, CrustinP and PA-SWD were probably involved in the shrimp immune system. Moreover, the Gly and Cys-rich region of Type II crustin and the Pro and Arg-rich region of Type III crustin might be important for antimicrobial action.

ครัสทินจัดเป็นเปปไทด์ต้านจุลชีพชนิดหนึ่งที่มีความสำคัญต่อระบบภูมิคุ้มกันของกุ้ง ซึ่งมีฤทธิ์ทางชีวภาพที่สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของจุลชีพได้ ในงานวิจัยก่อนหน้านี้ได้มีการศึกษาเกี่ยวกับครัสทินชนิดที่ 1 และ 2 พบว่ามีฤทธิ์ในการต้านจุลชีพหลายชนิด แต่พบว่ามีเพียงครัสทินชนิดที่ 3 เท่านั้นที่มีทั้งฤทธิ์ในการยับยั้งการเจริญเติบโตของจุลชีพและการทำงานของเอนไซม์โปรทีเนส ดังนั้นงานวิจัยนี้จึงสนใจที่จะศึกษายีนของครัสทินชนิดที่ 1 (Lvcarcinin), 2 (CrustinP) และ 3 (PA-SWD) รวมทั้งยีนบริเวณโดเมน WAP ของยีน CrustinP (WAP-PV) และยีนบริเวณโดเมน WAP ของยีน PA-SWD (WAP-SWD) ในกุ้งขาว (Litopenaeus vannamei) นอกจากนี้ยังได้ทำการเชื่อมยีนบริเวณกรดอะมิโนโพรลีนและอาร์จินีนของ PA-SWD เข้ากับยีน WAP-PV (PA-WAP-PV) อีกด้วย เพื่อนำไปศึกษาฤทธิ์ทางชีวภาพ ยีน Lvcarcinin, CrustinP, WAP-PV, PA-SWD, WAP-SWD และ PA-WAP-PV เป็นครัสทินที่ประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์จำนวน 336, 438, 163, 210, 156 และ 217 คู่เบส ตามลำดับ สามารถแปลรหัสเป็นกรดอะมิโนได้ 111, 145, 53, 69, 51 และ 71 โมเลกุล ตามลำดับ หลังจากนำยีนทั้ง 6 นี้ไปผลิตโปรตีนลูกผสมในระบบ Escherichia coli แล้วจึงนำไปทดสอบฤทธิ์ในการยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรียด้วยเทคนิค Agar diffusion assay พบว่า rLvcarcinin มีฤทธิ์ในการยับยั้งการเจริญเติบโตของ Bacillus subtilis ส่วน rCrustinP, rWAP-PV, rPA-SWD, rWAP-SWD และ rPA-WAP-PV มีฤทธิ์ในการยับยั้งการเจริญเติบโตของ Bacillus subtilis และ Staphylococcus aureus แต่อย่างไรก็ตาม WAP-PV และ WAP-SWD มีฤทธิ์ยับยั้งการเจริญเติบโตของจุลชีพได้ต่ำกว่า CrustinP และ PA-SWD ตามลำดับ นอกจากนั้นเมื่อนำโปรตีนลูกผสมไปทดสอบฤทธิ์ในการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ proteinase K พบว่ามีเพียง rPA-SWD และ rWAP-SWD ซึ่งเป็นยีนของครัสทินชนิดที่ 3 เท่านั้นที่สามารถยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ proteinase K ได้ ดังนั้นแสดงให้เห็นว่า Lvcarcinin, CrustinP และ PA-SWD น่าจะมีความเกี่ยวข้องกับระบบภูมิคุ้มกันของกุ้งขาวต่อการป้องกันการรุกรานของจุลชีพ นอกจากนี้บริเวณกรดอะมิโนไกลซีนและซิสเตอีนของครัสทินชนิดที่ 2 และบริเวณกรดอะมิโนโพรลีนและอาร์จินีนของครัสทินชนิดที่ 3 ยังมีความสำคัญต่อการต้านเชื้อจุลชีพอีกด้วย