DEVELOPMENT OF HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHIC METHOD FOR THE STUDY OF INFLUENCE OF FOLIC ACID ON CORDYCEPIN AND ADENOSINE PRODUCTION IN CORDYCEPS MILITARIS

Abstract

In this research, the effects of folic acid on cordycepin and adenosine production in Cordyceps militaris were studied using the developed high-performance liquid chromatographic method. The different concentrations of folic acid in the range of 0-50 mg/L were added into the culture media to evaluate their effects on cordycepin and adenosine production. The fruiting bodies were dried and extracted using ultrasound-assisted extraction (UAE) method for extraction of both cordycepin and adenosine produced by Cordyceps militaris. The optimal conditions were achieved using water as an extraction solvent for 30 minutes at room temperature. The chromatographic separation was performed on C18 column (4.6 x 150 mm, 5 µm) using 8% ethanol solution as a mobile phase with an UV detection at 260 nm. The results showed that both compounds were separated in 9.0 min at flow rate of 1.20 ml/min. The linear calibration curves were obtained over the concentration range of 0.02-200 mg/L for both cordycepin and adenosine with high correlation coefficients (R2> 0.999). The precision was measured in terms of relative standard deviation (RSD) values. The RSDs of the method were less than 2.5%. The limit of detection and limit of quantitation of cordycepin and adenosine were 5 and 20 ng/L, respectively. The percentage recoveries of cordycepin and adenosine were obtained in the range of 82.04-104.51% and 100.91-104.28%, respectively. The developed method was successfully applied for the separation of cordycepin and adenosine in Cordyceps militaris cultured in various folic acid conditions. The results showed that culture media with added folic acid significantly increased the production of cordycepin. However, folic acid was not significantly affected for adenosine production in Cordyceps militaris. It was found that Cordyceps militaris cultured in media with 0.1 mg/L of folic acid and provided the highest amount of cordycepin in the 13 weeks after stimulating by light. The amount of cordycepin was 2220.27 mg/100 g.

ในงานวิจัยนี้ได้ทำการศึกษาอิทธพลของกรดโฟลิกที่ส่งผลต่อการผลิตคอร์ไดเซปินและอะดีโนซีนในเห็ดถั่งเช่าสีทอง (Cordyceps militaris) ด้วยเทคนิคโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูงที่พัฒนาขึ้น โดยศึกษาการเติมกรดโฟลิกที่แตกต่างกันในช่วงในระดับความเข้มข้น 0-50 มิลลิกรัมต่อลิตร ลงในอาหารเพาะเลี้ยงเพื่อศึกษาปริมาณการผลิตคอร์ไดเซปินและอะดีโนซีนโดยนำดอกเห็ดที่เพาะเลี้ยงในสภาวะต่าง ๆ มาทำให้แห้ง และสกัดแบบการใช้คลื่นอัลตราซาวด์ (UAE) ในสภาวะที่เหมาะสมที่มีน้ำเป็นตัวทำละลายเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เพื่อแยกคอร์ไดเซปินและอะดีโนซีนออกจากเห็ดถั่งเช่าสีทอง จากนั้นนำสารสกัดมาวิเคราะห์ด้วยคอลัมน์ C18 (4.6 x 150 mm, i.d.) ที่มีสารละลายเอทานอลเข้มข้นร้อยละ 8 โดยปริมาตร เป็นวัฏภาคเคลื่อนที่ และการตรวจวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 260 นาโนเมตร ผลการทดลองพบว่าสามารถแยกคอร์ไดเซปิน และอะดีโนซีนได้พร้อมกันภายในเวลา 9.00 นาทีที่อัตราการไหล 1.20 มิลลิลิตรต่อนาที โดยวิธีที่พัฒนาขึ้นให้ค่าความเป็นเส้นตรงของคอร์ไดเซปินและอะดีโนซีนในช่วงความเข้มข้น 0.02-200 มิลลิกรัมต่อลิตร โดยมีค่าสัมประสิทธิ์เชิงเส้นที่ดี (R2 > 0.999) มีความเที่ยงของวิธีในรูปของค่าความเบี่ยงเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ (RSD) น้อยกว่า 2.0% ค่าความเข้มข้นต่ำสุดของการตรวจวัด และค่าความเข้มข้นต่ำสุดของการวิเคราะห์ปริมาณของสารออกฤทธิ์ทั้ง 2 ชนิด เท่ากับ 5 และ 20 นาโนกรัมต่อลิตร ตามลำดับ และมีค่าร้อยละการคืนกลับของคอร์ไดเซปิน และอะดีโนซีน อยู่ในช่วง 82.04-104.51% และ 100.91-104.28% ตามลำดับ สำหรับการประยุกต์วิธีที่พัฒนาขึ้นนี้ในการตรวจวิเคราะห์คอร์ไดเซปิน และอะดีโนซีนแบบพร้อมกันในตัวอย่างเห็ดถั่งเช่าสีทองที่เพาะเลี้ยงในอาหารที่มีการเติมกรดโฟลิกความเข้มข้นต่าง ๆ พบว่าการเติมกรดโฟลิกลงไปในอาหารเพาะเลี้ยงช่วยเพิ่มปริมาณการผลิตคอร์ไดเซปินอย่างมีนัยสำคัญ อย่างไรก็ตามกรดโฟลิกไม่ได้มีผลอย่างมีนัยสำคัญต่อการผลิตปริมาณอะดีโนซีนในเห็ดถั่งเช่าสีทอง จากผลการทดลองพบว่าเห็ดถั่งเช่าสีทองที่ทำการเพาะเลี้ยงในอาหารที่เติมกรดโฟลิกความเข้มข้น 0.1 มิลลิกรัมต่อลิตร ลงไปทำให้มีปริมาณการผลิตคอร์ไดเซปินมากที่สุดในสัปดาห์ที่ 13 หลังกระตุ้นแสง โดยปริมาณคอร์ไดเซปินเท่ากับ 2220.27 มิลลิกรัมต่อ 100 กรัม